NGS步骤已被宽泛用于检测大无数序列变异。然而

，这些步骤无法正确解析基因组中复杂的沉复或高GC含量区域。这使得结构变异的检测尤其拥有挑战性。利用Bionano 光学基因组图谱技术 (Optical genome mapping,OGM)

，能够在高活络度下以无偏、全基因组的方式检测结构变体。这项革命性的技术揭示了传统测序和细胞遗传学分析之前的“盲点”
；然而

，它必要分离超高分子量（UHMW）DNA。超长分子的长度通常在250 kbp以上甚至超过1 Mbp

，传统的提取步骤很难齐全获取。为了应对这一技术挑战

，Hamilton与Bionano Genomics合作开发了提供超高分子量DNA提取的自动化解决规划-Long String VANTAGE. 这使得基因组DNA提取过程中大大削减了碎片的产生。从这一自动化过程中提取的超高分子量DNA进而被象征

，并为光学基因组作图（OGM）分析天生高质量数据。

在不休发展的基因组钻研领域

，技术创新为深刻相识以前尚未解决的基因组生物学问题提供了机遇。超长DNA分子的画图扭转了我们对待基因组的方式

，对其结构的分辨率达到了很高的水平。Hamilton提供超高分子量DNA提取的自动化解决规划-Long String Vantage. 利用这种高效、省时的样本处置解决规划

，能够更高通量的实现光学基因组作图（OGM）。

步骤描述

‍该步骤基于 Bionano Prep SP 冷冻细胞沉淀 DNA 提取步骤

，并对自动化过程进行了优化。简言之

，将约100万个细胞的冷冻 HL-60 细胞沉淀手动沉悬于含有 RNase A 的 DNA 不变缓冲液中

，并搁置在96深孔板中。后续步骤将在Long String VANTAGE 仪器上自动化执行。

细胞裂解和蛋白酶 K消化将在特造缓冲液中进行。随后通过参与 PMSF 终止该过程。通过参与异丙醇将 UHMW DNA 结合到 Bionano Prep SP Disk上。随后进行3个洗涤步骤

，从结合的DNA中去除杂质。对于最终洗脱

，将Disk转移至微孔板顶部的预填充洗脱缓冲液条中。

最后

，用户能够在台面表进行离心步骤

，将最终洗脱液留在微孔板中

，将Disk保留在 Hamilton 洗脱条中。该过程获得了合用于 Bionano Genomics 下游直接象征和染色 (DLS) 过程的 UHMW DNA 提取物。该过程基于酶法进行基因组特异性象征

，最终可在Bionano Genomics Saphyr ®系统上网络数据。

系统描述

Long String VANTAGE 是一种即用型工作站

，拥有尺度化硬件配置

，合用于自动化magnetic disk或磁珠处置工作流程。本品仅合用于钻研用处 (RUO)。其基于Microlab ®VANTAGE平台

，拥有4个1 mL CO-RE ®移液通路以及4个用于disk处置步骤的5 mL CO-RE®通路。

利用软件

Long String VANTAGE VENUS框架是专门为该步骤而设计和开发的。

试剂盒描述

Bionano 的 SP 血液和细胞造就 DNA 分离试剂盒 (80042) 是在Long String VANTAGE 上开发UHMW DNA 提取自动化工作流程的基础。该步骤通过单一的裂解、结合、洗涤和洗脱流程来获得UHMW DNA。该试剂盒使用的是由纳米结构二氧化硅表表覆盖的顺磁盘

，而不是磁珠或硅基离心柱。这提供了高 DNA 结合能力

，并有助于
；そ岷系 DNA 免受剪切力粉碎
；厥盏 UHMW DNA 大幼通常在 250 kbp 至 > 1 Mbp之间

，浓度领域为50-120 ng/µL。

可视化流程

使用人白血病细胞系HL-60细胞沉淀测试自动化规划。

HL-60细胞（DMSZ

，ACC3）在DMEM+10%FBS和双抗造就基中于37°C

，含5%CO2的湿润环境中造就。通过离心网络细胞

，并在使用前作为1.5 M HL-6细胞的细胞沉淀在-80°C下冷冻存储。在尝试当天

，将细胞沉淀在37°C下解冻30秒

，并通过手动移液将其沉悬于40μL DSB/RNase Cocktail混合液中。将得到的细胞悬浮液归并

，将对应于100万个细胞的体积转移到96深孔板的单个孔中

，并提供给Long String VANTAGE。在对层叠在洗脱板顶部的条带进行裂解和消化、结合、洗涤和Disk转移后

，在室温下以2200 rcf对洗脱板组件进行离心1分钟。

该步骤成功的得到验证

，每次可处置12个样品。使用一样参数共进行了4次验证试验（3次试验

，4个样品

，1次试验

，12个样品）。

在Long String VANTAGE上洗脱UHMW DNA后

，使用尺度200μL吸头将样品剪切4次

，而后在Hula混合器上进行1幼时颠倒混匀

，并在室温下孵育过夜。凭据说明书

，使用Qubit dsDNA BR检测试剂盒对UHMW DNA进行定量。而后使用Bionano Prep直接象征和染色（DLS）规划的优化版本象征DNA。凭据系统用户指南

，使用Qubit 1X dsDNA HS检测试剂盒对象征的DNA进行定量

，并将其加载到Bionano芯片上

，在Saphyr仪器上运行。网络所有样品大于150kbp分子的400Gbp光学数据。

技术

Hamilton专有的磁棒技术确保了较佳的Magnetic Disk处置。Paramagnetic Disk可通过5ml移液通路直接操作

，无需额表的台面设备？傻鞑问柚萌繁＝霞殉⑹粤司。

Hamilton Magrod套筒以较高的精度造作

，并凭据可能的较佳Magnetic Disk定位进行塑形。匹配可
；agrod免受周围液体和试剂的影响。Hamilton洗脱条用于通过离心从最终UHMW DNA样品中分离Magnetic Disk。Disk保留在条带中

，而洗脱液被吸入微量滴定板。

了局

自动化过程获得的了局批注

，样品产率是可沉复的

，并切合Bionano Prep SP冷冻细胞沉淀DNA分离规划（图A

，蓝条）中划定的手动提取的预期值。

DLS象征后进行额表的样品浓度丈量

，以确保有足够的产量用于进一步处置（图A

，灰点）。数据批注

，对于在Long String VANTAGE上分离的所有样品

，都回收和体现了相宜量的产品DNA。

在Saphyr仪器上运行的样本数据分析批注

，分子长度超过了Bionano Genomics提供的阈值

，并证明存在大于230 kbp的超高分子量DNA（图B）。从Hamilton Long String VANTAGE分离的DNA蕴含Mbp长度的分子

，在提取、象征、线性化和成像后

，其总体上超过了230 kbp的OGM质量阈值。

从Saphyr仪器网络的数据中得出了进一步的质量节造指标（下图）。所有样本在特异性和活络度领域内均显示出一致的象征机能（下图A、B）。Map率超过了Bionano Genomics提供的质量指标阈值（下图C）。

Long String VANTAGE可在一个工作日（8幼时）内处置多达12个样品。这比手动步骤的效能显著增长

，建议每次运行6个样本。

结论

作为精密自动化液体处置的专家和对基因组工作流程的关注

，Hamilton在进入这个利用领域。我们与Bionano Genomics合作

，成立了超高分子量DNA提取自动化解决规划。结合光学基因组作图

，Long String VANTAGE将可能以从样本中尺度化且可沉复地提取超高分子量DNA

，赋能您的基因钻研。